il virus dell’epatite E (HEV) è trasmesso per via feco orale: la letteratura segnala che animali quali il maiale possono rappresentare serbatoi naturali del virus. La diagnosi di laboratorio è correntemente effettuata con il rilevamento degli anticorpi verso il virus (anti HEV); tuttavia il loro significato e la specificità/sensibilità dei test in commercio è tuttora discussa. Obiettivo della ricerca è la messa a punto di un sistema di diagnosi con PCR real time, che permette una valutazione quali quantitativa, in grado di: (i) eseguire una ricerca diretta di HEV su sangue e feci, (ii) fornire una valutazione quantitativa sul numero di genomi virali/campione. Metodi: i primers di PCR sono stati disegnati sulla sequenza di riferimento in una regione altamente conservata nel genoma dell’HEV (GenBank accession number X98292). La PCR real time è stata eseguita con il sistema LightCycler (Roche) con il kit “RNA Amplification Kit SYBR green I”. Esperimenti di ricostruzione sono stati eseguiti con cDNA sintetico (diluito da 106 fino a 1 molecola/2ul) e con 5 campioni di feci umane provenienti da: 4 pazienti anti HEV negativi ed 1 positivo per la ricerca diretta dell’HEV RNA (RT PCR). La metodica è stata quindi utilizzata per la ricerca di HEV RNA in 22 sieri umani (anti HEV positivi) e 152 sieri suini provenienti da diversi allevamenti della Sardegna. Risultati: nei campioni di riferimento (feci) è stata rilevata negatività per quelli provenienti da pazienti HEV negativi, mentre il campione positivo ha mostrato una concentrazione pari a 1:107 cDNA/gr di feci. Tutti i sieri umani e suini sono risultati negativi con PCR real time. Conclusioni: il metodo ha mostrato una buona sensibilità (10 cDNA/2ul) e specificità. La viremia transitoria, già descritta in letteratura nella maggioranza dei soggetti colpiti dall’ infezione, può spiegare il risultato negativo per i sieri anti HEV positivi
Ricerca diretta dell'HEV-RNA mediante PCR real time
ORRU, GERMANO;COPPOLA, ROSA
2003-01-01
Abstract
il virus dell’epatite E (HEV) è trasmesso per via feco orale: la letteratura segnala che animali quali il maiale possono rappresentare serbatoi naturali del virus. La diagnosi di laboratorio è correntemente effettuata con il rilevamento degli anticorpi verso il virus (anti HEV); tuttavia il loro significato e la specificità/sensibilità dei test in commercio è tuttora discussa. Obiettivo della ricerca è la messa a punto di un sistema di diagnosi con PCR real time, che permette una valutazione quali quantitativa, in grado di: (i) eseguire una ricerca diretta di HEV su sangue e feci, (ii) fornire una valutazione quantitativa sul numero di genomi virali/campione. Metodi: i primers di PCR sono stati disegnati sulla sequenza di riferimento in una regione altamente conservata nel genoma dell’HEV (GenBank accession number X98292). La PCR real time è stata eseguita con il sistema LightCycler (Roche) con il kit “RNA Amplification Kit SYBR green I”. Esperimenti di ricostruzione sono stati eseguiti con cDNA sintetico (diluito da 106 fino a 1 molecola/2ul) e con 5 campioni di feci umane provenienti da: 4 pazienti anti HEV negativi ed 1 positivo per la ricerca diretta dell’HEV RNA (RT PCR). La metodica è stata quindi utilizzata per la ricerca di HEV RNA in 22 sieri umani (anti HEV positivi) e 152 sieri suini provenienti da diversi allevamenti della Sardegna. Risultati: nei campioni di riferimento (feci) è stata rilevata negatività per quelli provenienti da pazienti HEV negativi, mentre il campione positivo ha mostrato una concentrazione pari a 1:107 cDNA/gr di feci. Tutti i sieri umani e suini sono risultati negativi con PCR real time. Conclusioni: il metodo ha mostrato una buona sensibilità (10 cDNA/2ul) e specificità. La viremia transitoria, già descritta in letteratura nella maggioranza dei soggetti colpiti dall’ infezione, può spiegare il risultato negativo per i sieri anti HEV positivi
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